1. 悬滴培养法
悬滴培养法是由Harrion等人提出的一种三维细胞培养技术，利用载有细胞悬滴的培养液通过表面张力形成无骨架的三维细胞球体。
与其他三维培养方法相比，这种方法操作简便，促进细胞间紧密聚合，增强细胞间及细胞与基质的相互作用，从而提高了细胞的分化潜力。
然而，悬滴培养法也存在一些问题，例如培养环境难以控制，细胞悬滴容易污染且不易悬浮。
此外，细胞聚合物在培养过程中可能因氧气和营养物质不足而导致中心坏死。通过控制细胞接种数量，可以避免这一问题。
为了克服这些限制，悬滴培养法可以与芯片技术结合使用，如微流体悬滴芯片和超疏水芯片，利用泵装置持续更新培养基，补充消耗的氧气和营养物质，支持细胞的长期培养。
2. 微流控芯片
微流控芯片是一种基于微流体控制技术的设备，包含微米级的培养室、通道和微泵等功能组件，能够对细胞、组织和化学试剂进行精确的制备、反应、分离和检测。
这种芯片通常由水相和油相两种不相容的流体组成的微米级通道构成，当含有细胞的水相液体在油相中流动时，会形成水相的多细胞球体。
微流控芯片具有以下优点：
①能够通过调整动态参数，精确控制细胞在微米级通道中的流动，模拟特定环境以满足多细胞球体的培养需求；
②能够精确控制多细胞球体的体积和剪切应力，减少细胞损伤并降低试剂消耗；
③在空间和时间上对细胞的微环境进行精准调控，可调节物质浓度、溶液温度、pH值等，更加真实地模拟干细胞在体内的复杂环境，广泛应用于疾病机制研究和药物筛选等领域。
3. 磁悬浮培养法
磁悬浮培养法是一种利用磁力使细胞与磁性颗粒结合，从而保持细胞悬浮状态的三维培养技术。
通过调节磁场，可以精确控制细胞团的形状，促进细胞间的接触与聚集，形成细胞球体。
这种培养法具有多项优势：成本低、操作简便、生物兼容性好，且培养的细胞活力强，球体核心的坏死现象较少。
与传统的三维培养技术相比，磁悬浮法能更快速地形成细胞球体，且这些球体能够紧密连接并自主分泌内源性ECM，免去了使用人工基质或特殊培养介质的需求，且球体能够长期培养。
另外，磁悬浮培养法还可以通过调节磁场强度来改变细胞球体的形状，即使移除磁场，细胞球体的结构仍然保持完整。
与无磁性的三维培养物相比，磁性培养物的结构更加紧密，含有更多的脂滴和细胞外囊泡，且具有更强的分化潜能。
同时，这种方法培养的细胞在多系谱分化能力、表面标志物、胞外基质的表达，以及成骨和血管生成蛋白的水平上，都显著高于二维培养或其他三维聚集体。
4. 旋转细胞培养系统（RCCS）
RCCS（转壁式生物反应器）是一种采用微载体技术，通过模拟微重力环境使细胞、组织和培养液在类似自由落体的状态下旋转，从而生成既能贴壁又能悬浮的三维细胞球体，进而用于大规模细胞扩增。
这种系统通过微重力环境和低剪切应力，促进细胞的增殖和诱导分化。
与静态培养方法相比，RCCS培养的细胞受到的外界机械力较小，机械损伤较少，细胞自由度较高，更容易形成三维球体。
在RCCS反应器中，细胞处于自由落体状态，转动和混合不受重力单一方向的限制，从而允许细胞向各个方向生长。
微重力环境还影响细胞内部微管的聚合和解聚，减少内部压力，导致分子水平的变化，使细胞能够维持良好的形态。
此外，细胞在培养过程中受到血液流动引起的剪切力影响，增强了应力纤维的形成，延缓了细胞的增殖速度，减缓了衰老过程，从而使细胞在后续实验中保持更好的活性。
5. 离心成球培养法
离心成球培养法通过离心增强细胞间的黏附力，将细胞沉淀后重悬于培养基中，然后将其分配至具有细胞排斥表面的96孔培养板，形成三维细胞球体。
该方法能够模拟细胞在体内的发育过程，加强细胞间及细胞与ECM的相互作用。
由于使用非蛋白质水溶性基质，细胞球体的分离过程迅速高效。与单层培养相比，离心成球培养法得到的大鼠DPSCs三维培养模型的细胞增殖能力变化不大，但其碱性磷酸酶（ALP）活性显著提高。
ALP通过调节胶原合成，促进牙本质的矿化，因此可在龋病和牙髓病治疗中发挥重要作用。
6. 液体覆盖法
液体覆盖法通过使用低黏性非贴壁培养板，减少细胞与培养板表面的吸附，从而促使细胞间相互吸引，聚集形成细胞球体。
低黏性表面通常由琼脂、琼脂糖凝胶或聚甲基丙烯酸甲酯等材料制成，这些材料有效抑制细胞附着。
液体覆盖法操作简便、成本低，不需要专用设备，且细胞所受的剪切应力较小，易于接触细胞球，适合长期大规模培养细胞球体。
然而，这种方法也存在一些缺点：
①液体覆盖法属于静态培养，培养基中的物质保持静止状态，代谢产物会随着培养时间积累，可能对细胞的正常生理活动产生不利影响；
②在低吸附表面的非贴壁培养板上，细胞球体的生长容易受到干扰，导致培养的重复性较差。
7. 人工支架法
常规的细胞体外培养通常缺乏细胞外基质（ECM）成分，这可能不利于细胞的存活和增殖，尤其对干细胞的培养产生较大影响。
人工支架法通过模拟天然ECM，改善细胞的增殖活性。
该方法将细胞接种在由人工基质构成的支架上，细胞在附着于支架后会逐渐迁移到支架内部，并在支架的孔隙中形成三维细胞球体。
水凝胶是常用的模拟ECM的生物材料，具有三维网状结构和优良的生物相容性，能够为细胞的黏附、生长和迁移提供支撑。
通过调节水凝胶的物理特性，或根据具体研究需求引入不同的官能团，可以创造出适合特定细胞生长和分化的微环境。
天然水凝胶（如胶原蛋白）不仅为细胞提供支撑，还为细胞间的物质交换提供了良好的空间，且具有可降解性和低毒性等优势。
研究表明，尤其是Ⅰ型胶原蛋白，能够有效促进牙髓干细胞的增殖和矿化。
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