微流控技术在类器官药物筛选中的应用

1.    类器官

类器官（Organoid）是由干细胞在体外培养和分化形成的三维微型细胞结构，来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞或肿瘤干细胞。

在特定条件下，这些干细胞自组织为具有特定功能的细胞群，形成与相应器官相似的组织结构和遗传特征。

尽管类器官不是真正的完整器官，但能再现复杂的细胞异质性和空间结构，长期稳定传代培养，模拟体内器官的功能。

微流控技术在微量流体的精确操控和高通量能力方面满足了类器官研究的需求。

通过调控培养环境的物理和化学参数，如营养物质浓度和废物排出，微流控技术能够动态模拟体内环境，提高类器官对生理和病理过程的反映真实度。

此外，微流控技术支持独立类器官的连续生成和高通量药物筛选，加快了药物测试和疾病研究的进程，提高实验效率。

2.    微流控高通量类器官培养

微流控类器官培养不同于常规孔板的形式，通常都会构建高通量的独立培养单元，这些高通量的技术以具体的实现形式可分为3类：微流控液滴、微孔和微柱。

1)    微流控液滴类器官培养技术

微流控多相流液滴技术通过在微通道中操纵两种或更多不互溶液体，以汇流或夹流方式生成液滴，具备快速且超高通量的液滴生成能力。

这一技术有效减少了试剂消耗，并保障了类器官培养的一致性。油包水液滴中，细胞悬液作为水相，被添加了表面活性剂的油相作为连续包裹相，通过调节两相流速，高通量地生成尺寸可控的液滴，后续培养可获得类器官。

然而，这种方法导致液滴被油包围，限制了营养物质的递送和废物的排出，难以实现连续长期培养。

为此，改进的水凝胶类器官培养方法应运而生，使用水凝胶细胞溶液作为被包裹水相，细胞预先悬浮在水凝胶中，通过微流控夹流生成水凝胶液滴。

水凝胶固化后形成固相细胞凝胶球，在水相中培养形成类器官，凝胶球外的水溶液可以不断为细胞提供营养，并带走代谢废物，实现类器官的长期培养。

目前，使用的凝胶材料包括海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖和聚乙二醇等。

2)    微流控生物打印类器官培养技术

微流控生物打印通过将目标细胞悬浮于可生物降解的水凝胶中，通常还加入支架材料和生长因子，形成生物墨水。该技术能够灵活控制生物材料和细胞的空间堆积方式，从而创建复杂的肿瘤模型。

生物墨水可以以复合物平面阵列的形式打印在开放基板上或分配到多孔板中，生成位置高度可控的类器官液滴阵列，使高通量药物筛选成为可能。

在几秒内可以生成一个类器官，研究表明平行打印的类器官之间具有高度可重复性。

结合多相流液滴生成与基质胶液滴的3D打印技术，类器官的生成速度得以提高，10分钟内可生成1000个类器官，并以每秒1个的速度将其接种至对应孔中。

得益于基质胶液滴中的高细胞密度，类器官的成熟时间缩短，同时类器官之间的一致性也显著改善。

3)    微流控微孔阵列类器官培养技术

微孔阵列是微流控细胞捕获、聚集和3D培养的常用方法，通过调控微结构特征，可以控制类器官的尺寸，获得均一的类器官。

应用规模化的微孔阵列，可实现高通量的类器官培养。微孔阵列可通过模具法、直接铣削或3D打印等方式制备，不同形状和材质的微孔有助于细胞的均匀聚集和类器官的形成。

该系统不使用基质胶，能够对微孔阵列中的类器官进行实时分析。相同数量的细胞在微孔内聚集，可以加快类器官的生成速度，并同步群体内的异质细胞生长，提高批量培养的一致性。

每个微孔内生长的单类器官便于进行连续的动态形态监测，同时也支持免疫组化、基因组和转录组等后续分析。

4)    微流控微柱阵列类器官培养技术

微柱阵列同样适用于细胞的捕获、聚集和空间分离，从而实现类器官的培养。细胞在微柱间隙中被截留，并在阵列中进行类器官的分化和发育。

微柱间隙方便溶液流通，因此常与灌流芯片结合，支持类器官的长期培养。该系统还可用于研究动态流体对类器官发育和功能的影响。灌流培养液不仅避免了频繁的换液操作，还实现了营养物质的有效递送和废物的排出。

与静态培养相比，灌流微柱平台上的类器官表现出更好的细胞活力和更高的器官特异性基因表达。此外，另一种微柱策略是在各微柱的端面上进行类器官的培养，将含细胞的凝胶液滴固定在微柱端面上，便可实现批量类器官培养。

这种方法可一次性对微柱阵列中的类器官进行换液处理，支持长期培养，并大幅减少试剂消耗。

3.    微流控技术在类器官药物筛选中的应用

类器官药物筛选因应用出口的不同分为两大类：

其一为临床肿瘤药物的筛选，即肿瘤类器官药物敏感性测试，类器官细胞来源为患者的穿刺或手术切除样本，所培养的类器官称之为患者来源类器官（PDO）；

其二为新药的高通量筛选，类器官细胞来源为干细胞和肿瘤细胞系，进一步培养为各种组织和肿瘤类器官，用于新药的药效和毒理筛选。

1)    患者来源肿瘤类器官药物敏感性测试

超疏水微孔阵列芯片实现了纳升尺度的液体操控，应用于类器官培养。该系统能在1周内完成肿瘤类器官的药物敏感性测试，与临床数据高度一致，显示出其在预测患者治疗反应中的潜力。

同时，该技术使得活检样本的类器官培养成为可能。利用多相流液滴微流控技术，从少量组织中生成数千个微器官球，实现肿瘤药物反应的快速预测。

构建具有复杂微环境的PDO仍是挑战，尤其是在模拟肿瘤微环境（TME）方面。

通过微流控技术共培养间充质干细胞、外周血免疫单核细胞与肝癌细胞，成功模拟肝癌类器官的TME，提高了免疫治疗反应的预测精度，证明了微流控技术在PDO中对免疫疗法效果预测的重要性。

2)    干细胞来源类器官新药筛选

类器官通过人源干细胞分化培养获得，具备与对应器官高度相似的空间组织结构，能够真实重现器官功能和药物响应。

因此，类器官替代二维细胞和动物实验进行药物筛选，可获得更高的临床一致性，且具有速度快、通量高、成本低的优势。

此外，类器官为深度测序、功能检测和表型分析提供了丰富资源。

基于常规细胞系的高通量药物筛选平台，采用移液机器人和细胞培养瓶、多孔板等，实现了细胞培养和分化过程的自动化，能够快速标准化生产数十亿个iPSC，支持高通量药物筛选。