采用激光诱导和激光刻蚀技术，成功制备了一种 LIG/PDMS 微流控芯片，用于细胞冷冻保存。
表面接触角为 157.8℃的超疏水石墨烯表面抑制和延缓了冰晶的形成，还表现出优异的光热效应。
得益于上述特性，将其用于细胞冷冻保存辅助载体时，经冷冻保存和复苏处理后的卵母细胞存活率为 92.4%。
1. 细胞冻存技术
细胞冷冻保存技术是利用极低的温度（-80或-196℃）实现器官、组织、细胞和其他生物材料长期保存的一项技术。
冷冻保存的细胞或组织不仅可以保持正常的结构，解冻后还可以保持完整的功能，应用于进一步的基础研究和临床应用。
细胞冷冻保存过程包括冷冻保护剂的加载，冷冻保存，复温，冷冻保护剂的去除四个步骤。
目前，细胞冷冻保存过程面临的问题有来自二甲基亚砜（DMSO）等常用冷冻保护剂的生物毒性对细胞造成的毒性损伤，冷冻保存以及复温过程中细胞内外冰晶形成和长大导致冰晶损伤，细胞内外的化学势不同产生的渗透性损伤以及温度变化过程造成的冲击损伤。
其中，冰晶的形成和生长以及冷冻保护剂的毒性是危害细胞复苏以及后续活力的主要问题。
2. 微流控芯片制备
1) 芯片材料
微流控技术具有小剂量分析、高通量、精确控制、灵活集成等优点，近年来在被尝试用于细胞冷冻保存。
有研究提出，使用微流控芯片进行冷冻保护剂的加载和卸载可以减少产生渗透损伤。
将保护剂添加、冷冻保存、复温步骤整合成一体化的微流控芯片是一种新型策略。
同时，考虑到与细胞一起冷冻时，相对尺寸较大的微流控芯片会导致细胞复温速率降低，制备出的微流控芯片也需要具备热管理能力。
石墨烯具有优良的光热效应和热导率，良好的生物相容性使其在生物医学领域也有很好的应用前景。
将石墨烯材料与微流控芯片相结合，石墨烯的光热效应可以使其在复温阶段通过激光照射显著提高复温速率，可以解决复温速率显著降低无法满足细胞升温速率要求的问题。
因此，芯片使用三维激光诱导石墨烯（3D LIG），通过真空浸渍聚二甲基硅氧烷（PDMS）获得LIG/PDMS复合材料，用于微流控芯片基底。
2) 微流控芯片设计
常见的癌细胞如Hela、A549等直径约为10µm；精子总长度约为55µm，头部直径约5µm；干细胞大小约10~15µm；卵母细胞直径约100µm。
据此设计深度为 200µm、宽度为 200µm 的微通道，以满足多种细胞在微通道内的流通。由于微通道深度为200µm，基底厚度设计为400µm以便于加工。
图（a）为Y型结构，包括两个进液口和一个出液口。
冷冻保存细胞时，细胞悬浮液和冷冻保护剂分别从进液口注入，在微通道内部混合后从出口流出。
图（b）为I型结构，包括一个进液口和一个出液口。
图（c）为 S型捕获结构，包括两个进液口、一个出液口以及中间的捕获结构。
在满足细胞和冷冻保护剂分开注入需求的同时，Y型结构较为简单、易于加工，因此采用简单的Y型结构作为细胞冷冻保存的微通道结构。
3) 微流控芯片基底的制备
首先使用二氧化碳激光器作为光源，扫描PES膜，将PES膜诱导转化为石墨烯（LIG）。
然后重复数次覆盖PES 膜扫描，获得具有一定厚度的LIG。
复合PDMS获得LIG/PDMS复合材料，利用光纤激光器在LIG/PDMS复合材料上加工获得微通道。
a) 激光诱导石墨烯（LIG）的制备
宏观厚度的3D LIG采用激光诱导技术通过layer-by-layer法制备。
首先使用PI膜作为基底置于激光器的真空吸附平台上，然后将PES膜平整覆盖在PI膜上真空吸附紧实。
采用CO2激光打标机在空气气氛下扫描覆盖在PI基底上的PES膜。激光扫描区域为40mmх20mm。
利用二氧化碳激光将PES膜转化为三维多孔石墨烯，再次覆盖一层PES膜重复进行扫描增加石墨烯厚度。
b) LIG/PDMS 复合材料的制备
为了解决LIG自身存在问题，采用未固化的PDMS溶液对LIG进行真空浸渍复合。
作为一种具有优良柔韧性和生物相容性的有机硅材料，PDMS 的渗入有助于提高LIG 的柔韧性，且LIG的高孔隙率可以使PDMS预聚物的渗透更加均匀，获得复合良好的LIG/PDMS复合材料。
c) LIG/PDMS 激光蚀刻
相较于传统微流控芯片软光刻工艺需要定制掩膜的复杂性和高成本，激光蚀刻操作简单且成本较低。
但由于激光扫描过程中能量较大，对于超细微通道结构仍需要调节并选择合适的加工参数。
对加工后的LIG/PDMS 微流控基底表面进行超声清洁，可以去除光纤激光加工过程中的飞溅，在下一步的芯片粘合过程中产生更紧密的结合。
d) 表面超疏水处理
优异的疏水表面对冰的形成和霜的积累具有显著的抑制作用。
超疏水表面通常指表面与水的静态接触角大于 150°的固体表面。
由于其独特的结构和性能被广泛研究，可应用到防腐蚀、防结冰、自清洁等及其他领域。
目前，常用的超疏水表面制备方法有很多，如激光刻蚀法、溶胶-凝胶法、气相沉积法、喷涂法等，此芯片使用激光蚀刻的方法。
3. 研究结果
（1）对 LIG/PDMS 微流控芯片进行 MTT 细胞毒性测试，使用 MTT 法将样品与细胞共同孵育 24h 后，Hela 细胞和 A549 细胞仍旧能够保持 90%以上的相对存活率，证明 LIG/PDMS 微流控芯片无毒。
同时，将 A549 细胞培养在样品表面，48h后观察细胞图像，实验结果表明，LIG/PDMS 微流控芯片具有良好的生物相容性。
（2）应用 LIG/PDMS 微流控芯片对 Hela 细胞冷冻保存，使用激光辅助复温，实验结果表明，在将冷冻保护剂中的 DMSO 含量降至 2.5%（正常冷冻保存 DMSO添加量为 10%）的同时，可获得高达 98.28%的细胞存活率。
证明 LIG/PDMS 微流控芯片将是一种出色的多功能冷冻载体，可以有效地减少经典有毒冷冻保护剂DMSO 的使用。
（3）应用 LIG/PDMS 微流控芯片对卵母细胞细胞冷冻保存，分别在室温下和激光辅助下进行复温实验。
实验发现，激光照射辅助复温下，CPA-2 组可获得 92.4%的卵母细胞存活率（对照组 85.8%）。
在冷冻保护剂中 DMSO 含量为 0 时，依然保持 88.3%的卵母细胞存活率，高于对照组。
研究证明，LIG/PDMS 微流控芯片是一种能够确保回收卵母细胞的活力和功能的高效方法。
通过对 DMSO 等有生物毒性威胁的冷冻保护剂的替代，能够有效提高冷冻保存后卵母细胞的活力和发育能力。
参考文献：[1]李怡芳.LIG/PDMS微流控芯片的制备及其在细胞冻存中的应用[D].重庆交通大学,2024.DOI:10.27671/d.cnki.gcjtc.2024.001008.
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