分子即时检测技术研究进展

什么是分子即时检测（POCT）技术

分子POCT技术集成了分子诊断技术和POCT技术，具有智能化、便携化、速度快、操作简便等优势，可在实验室和医院外由非专业人员进行操作完成检验，由于等温扩增和微流控等技术的不断发展和成熟，分子POCT产品也得到了快速发展并逐步应用于临床检验。

目前分子POCT不仅可应用在感染性疾病的检验，也用于早期妊娠、遗传性疾病、肿瘤等方面的诊断。

与抗原抗体检验相比，核酸分子的POCT检验在灵敏度、重复性和特异性方面具有显著优势。

分子POCT的关键技术包括等温扩增技术和微流控技术，本文主要介绍这两项内容。

等温扩增技术

等温扩增技术是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术，主要包括环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、交叉引物扩增（CPA）等，其中，LAMP和RPA在新冠病毒等病原微生物核酸检验领域应用广泛。

环介导等温扩增技术

LAMP是在60℃～65℃的等温条件下对DNA分子进行快速扩增的技术。

其原理是DNA在60℃～65℃左右处于动态平衡状态，通过4条特异引物和嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶（BstDNA聚合酶）不断进行链的置换和循环复制。

反应步骤主要包括：

1）内引物结合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5’端结合，在一端形成环状结构，另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构；

2）哑铃状结构的单链DNA具有模板与引物的双重功能，在BstDNA聚合酶的催化下即可延伸；

3）内引物也能与环状结构结合，在酶的作用下延伸。

LAMP具有扩增效率高、反应时间短等优点，其扩增产物可通过电化学传感器、横向流动试纸条等方法快速判断结果，操作比较简单。

但是该技术的引物设计繁琐，灵敏度相对较低，容易形成气溶胶，导致结果假阳性，准确性和灵敏度都明显低于荧光定量PCR技术。

重组酶聚合酶技术

RPA利用同源重组的原理进行目的片段的扩增，在37℃～42℃的条件下，重组酶蛋白与寡核苷酸引物结合形成引物重组酶复合物，该复合物在双链DNA模板中找到靶点后与之结合，DNA双链发生置换形成D环结构，在DNA聚合酶的催化下进行DNA复制延伸。

期间，单链结合蛋白与游离的单链DNA结合，防止其与母链发生配对。

RPA在等温条件下进行核酸扩增，具有高特异性，扩增时间短，操作简便等优势。

但是该技术对引物的要求较高，目前还没有专门针对RPA进行引物和探针设计的软件工具；另外无法采用该技术检验短序列的核酸，且检验成本较高。

基于微流控技术的POCT芯片

随着Microfluidic Chip技术与等温扩增技术的不断发展，与之匹配的微流控芯片类型的种类不断丰富，如离心式等温扩增微流控芯片、集成式等温扩增微流控芯片、巢式等温扩增微流控芯片和液滴等温扩增微流控芯片等。

各类芯片优缺点各异，原理不同，其中离心式等温扩增微流控芯片和集成式等温扩增微流控芯片在病原微生物检验领域的应用广泛。

离心式等温扩增微流控芯片

Principles	以离心力为驱动力，通过主轴电机即可驱动多个独立的结构单元，在芯片上对样品分子进行分子诊断
vantage	无需外界驱动泵，降低芯片复杂程度
drawbacks	难以实现高复杂度、多功能性的反应过程，难以实现上百个样品的高通量或多重检验
Applications	新型冠状肺炎病毒、人乳头状瘤病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等

集成式等温扩增微流控芯片

Principles	将样本裂解、核酸提取、核酸扩增及分子检验整合于一体的微流控芯片
vantage	实现“样本入—结果出”的一体化检验，自动化程度高，降低环境要求和操作要求
drawbacks	芯片上的试剂存储时间有限，芯片设计复杂，成本较高，不利于推广
Applications	新型冠状病毒、大肠埃希菌等

巢式等温扩增微流控芯片

Principles	在微流控芯片上集成多步等温扩增反应，第一步为预扩增，为后续反应提供扩增模板
vantage	灵敏度较高、特异性强
drawbacks	芯片结构设计复杂、精确度要求高应用
Applications	新型冠状病毒等

数字液滴等温扩增微流控芯片

Principles	样本以液滴形式存在于双夹板结构的芯片之中，通过控制电压来实现对液滴的搬运、分离、混合等 操作，在芯片上实现核酸的裂解、提取、扩增、检验等分析操作
vantage	操作简便、检验时间缩短，实现绝对定量检验，灵敏度高
drawbacks	系统复杂、检验成本高，技术尚未成熟，稳定型和重复性有待提高
Applications	淋球菌、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等

未来展望

为了实现核酸检验的自动便携和简单快速，分子POCT产品相对简化了核酸提取、片段扩增和信号检验的过程，因此提取的核酸样本中往往杂质较多，容易对后续的PCR反应产生抑制，存在准确性较差、不同平台检验结果不一致等缺点。

POCT仍处于产业发展的初期阶段，相关的技术尚不完善，需要进一步提升分子POCT的技术水平和产品质量，提升其检验准确性和一致性。

目前分子POCT技术标准缺乏，不同于成熟的荧光定量PCR仪和数字PCR仪等专业设备，荧光定量PCR仪和数字PCR仪在环境、操作方法、操作人员等都有严格的标准规定，有效减少了影响检验结果的各种因素。

对分子POCT设备系统评价、操作人员培训、质量控制和保证等环节制定相关标准，有利于POCT技术的发展。

除了完善相关质量管理办法和标准外，还应该加快研制分子POCT适用的标准物质，建立分子POCT检验结果的标准化验证评价系统。

研究建立分子POCT产品的标准化质量控制体系，建立分子POCT检验评测标准也是分子POCT后续发展的关键之一。