微流控细胞培养芯片-顶旭微控

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构建一种灌胶简便的微流控芯片，用于细胞的三维培养，并可实现多参数调控细胞微环境，用于研究细胞不同的应激反应。同时，还考察该芯片形成稳定的浓度梯度和压力梯度的效果。

SU8模具加工

设计了一个由 3 通道组成的微流控芯片构型，整个微通道的高度为 220 μm。

中间通道用于细胞三维支架的构建，宽为 400 μm，2 个旁通道用于细胞培养液的更新、生化因子的浓度梯度以及压力梯度的生成，宽均为 500 μm，旁通道与中间通道之间分别由 4 个斜型微横桥连接，微横桥直径为 250 μm，作用是实现细胞与培养基的物质交换，以及施加对细胞的物理化学刺激。

同时由于微横桥的尺寸较小，通过毛细力的作用避免了水凝胶渗溢到旁通道中造成堵塞。

PDMS芯片加工

将 PDMS 预聚体与固化剂按照重量比 10 ∶ 1均匀混合，真空抽气去除气泡后，倒于 SU-8 硅模板上，80 ℃ 烘箱放置 20min，待 PDMS 固化后，从硅模板上剥离，将带有微通道结构的部分切割成 20 mm × 45 mm 的矩形。

将切割下来的 PDMS 片和载玻片同时放入等离子清洗器中，其中PDMS片带通道图样的面朝上，在25 W 微波功率和 26 Pa 氧压下，处理 20 s 后，立即将PDMS片和载玻片取出并将待键合面贴合在一起，轻度挤压，去除贴合面间的气泡，使两键合面紧密贴合，并分别在通道各出入口处打孔，制成微流控芯片( 见下图 ) ，灭菌后备用。

水凝胶灌入

将Ⅰ型胶原原液与 10 × DMEM 培养液，PBS 缓冲液，NaOH 溶液混合，制成约 3 g /L 的胶原预聚溶液。

将预聚液充分混合好后立即在室温下从中间通道的入口处轻轻注入，使胶原填满中间的通道以及两边的 8 个微横桥( 其中胶原加入蓝色染料以便于观察) ，在37 ℃下聚合 30 min，使其完全聚合后，放入 4 ℃ 的冰箱中备用。

芯片内浓度梯度和压力梯度的表征

微流控芯片内浓度梯度和压力梯度的表征将微通道在 PBS 溶液中平衡30 min。

将新配制的 0.1 mmol·L－1 的荧光素的 PBS 溶液用微注射泵以 2 μL·min－1 的流速从其中 1 条旁通道入口注入，同时另一旁通道以 2 μL·min － 1 的流速注入 PBS 液。以注入荧光素的那一刻计时，利用荧光显微镜每隔 5 min 拍照一次，共观察9 h。

最后用 Matlab 软件对中间通道的浓度梯度分布取不同时间点进行分析。本研究实现压力梯度的原理为通过调节 4 个出口的储液池液面高度差，在中间通道的三维支架内形成压力梯度。

为了使体积更加可观，实验中分别采用红、蓝染料加入 PBS 中，平衡 2.5 h 后，形成较稳定的压力差。将两边通道液面的高度差控制在 10 mm，根据压强公式 p = ρgh 可求出中间通道的压力差为 100 Pa。

在实验中，为了避免水分蒸发，在 4 个储液池液面分别接入液态石蜡进行封闭。将芯片置于高湿度的孵箱内，每隔2 h测量1次液面高度，测量 72 h。

三维培养和骨架染色

细胞接种于DMEM培养基中，含 10% 胎牛血清，于37 ℃、5% CO2 及饱和湿度的培养箱中孵育，2～3d 换液 1次。

贴壁生长的细胞长满 90% 时，经 0.25% 胰蛋白酶消化，然后将对数生长期细胞用于实验。将Ⅰ型胶原原液与 10 × DMEM 培养液，PBS 缓冲液混合，制成约 3 g /L 的胶原预聚溶液。

将细胞从培养瓶中消化下来，用培养基制成细胞悬液，将预聚液与细胞悬液混合均匀，细胞密度控制在 106 /mL，立即将细胞和Ⅰ型胶原混合液在室温下从中间通道的入口处轻轻注入，使细胞-Ⅰ型胶原混合液填满中间的通道以及两边的 8 个微横桥，在 37 ℃下聚合 30 min，使其完全聚合后，连接注射泵持续换液，放入孵箱中培养( 见图 ) 。

24 h 后用 FITC-鬼笔环肽进行细胞骨架染色。步骤如下: 预温 PBS ( 37 ℃ ) 清洗细胞 2 次，每次 10 min; 4% 多聚甲醛室温固定 5 ～10 min，PBS清洗细胞 3 次; 0．1% Triton X-100 /PBS室温破膜 3～5 min，PBS清洗细胞 3 次; 5 μL FITC-鬼笔环肽贮存液加入150 μL PBS 中配成工作液( 5 μg /mL) 并用以染细胞，室温染色 30～60 min; PBS 清洗细胞 3次; 吸去多余水分，加荧光封片液封片，荧光显微镜下观察，并拍照。用上述方法对普通培养瓶培养细胞进行骨架染色，用作对照实验。