单细胞测序技术

单细胞测序（Single Cell Sequencing，SCS）技术通过对单个细胞的基因组或转录组进行测序，获取关于基因组、转录组及其他多细胞层面的信息，帮助揭示细胞种群差异及细胞间的进化关系。

该技术可通过测定单个细胞的全基因组、转录组和表观基因组，深入解析与疾病发生和发展相关的复杂异质性机制，进而优化疾病的诊断、预后评估及药物治疗监测。

1.    单细胞分离方法

SCS的第一步是从组织样本中分离单个细胞，获得合适的单细胞悬浮液。

目前，已有多种技术用于单细胞分离，包括连续稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选（FACS）、免疫磁珠分离（IMS）、激光捕获显微切割（LCM）以及微流控平台等。

1)    连续稀释法

该方法基于细胞培养原理，通过逐步稀释细胞群体来制备单细胞样本。

由于操作简便、成本低且不依赖于特殊设备，该方法已成功应用于体外不同组织来源的干细胞和祖细胞的克隆形成分析。

2)    显微操作法

显微操作法是一种经典的单细胞分离技术，常用于分离未培养的微生物或早期胚胎。

该方法通过毛细管移液器在显微镜下从细胞悬液中吸取单个细胞，并对细胞的形态和着色特性进行目视检查。

3)    荧光激活细胞分选

荧光激活细胞分选技术（FACS）能够根据单个细胞的大小、粒度和荧光特性，每分钟分离数十万个细胞。

其主要优势在于高吞吐量、节省时间和自动化操作。

研究人员通过给靶细胞标记特定的荧光抗体，从而将目标细胞与其他细胞群体分离。

4)    免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法通过将磁珠与细胞表面的特定抗原结合，使细胞表面抗原与单克隆抗体结合。

与磁珠连接的细胞会被磁场吸附并保留，而未结合的细胞则不会留在磁场中，从而实现目标细胞的快速分离。

5)    激光捕获显微切割技术

激光捕获显微切割技术利用激光束熔化透明膜盖，然后通过冷却将细胞固定在胶黏膜上，从而快速而准确地从组织样本中提取单细胞亚群或单细胞悬浮液，以便进一步分析细胞的异质性。

6)    微流控平台

微流控平台是一种新型的高度集成系统，能够在几十到几百微米的通道中按顺序处理或操控少量流体，实现单细胞培养和测序。

这些通道已广泛应用于单细胞实验。

微流控的优势在于能处理纳升至皮升级别的样品量，并提供高分辨率和灵敏度的精准结果。

2.    单细胞测序分类

单细胞测序主要包括单细胞基因组测序（scDNA-seq）、单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单细胞表观组测序三种类型，它们从不同层面揭示细胞在各个阶段的功能与特性。

1)    单细胞基因组测序

单细胞基因组测序可用于分析单细胞层面的点突变和拷贝数变异，揭示细胞群体差异和细胞进化关系等，帮助准确识别单克隆癌细胞的突变来源及频率，并区分癌症发生、发展过程中的主动与被动突变。

其挑战在于获得高覆盖度和高保真度的全基因组扩增产物。

为此，全基因组扩增技术（WGA）在发展过程中经历了多次重要改进。

WGA主要包括三种方法：简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）、多位点置换扩增（MDA）和MDA与PCR结合的方法（MALBAC）。

2)    单细胞转录组测序

单细胞转录组测序能够对单个细胞中的mRNA进行基因表达定量、功能富集和代谢通路分析，解决了传统转录组测序在早期胚胎发育、干细胞、癌症和免疫研究中因样品量少或细胞异质性而面临的问题，是研究单细胞基因表达的有力工具。

该技术首先需要将提取的RNA进行逆转录，收集并扩增cRNA产物后进行测序。

由于单细胞转录组测序方法多样，实际应用中需根据具体情况综合评估，选择最适合的技术。

3)    单细胞表观组测序

单细胞表观组测序能够从单细胞层面获取全基因组范围的甲基化数据，对研究表观遗传学的时空特异性具有重要意义。

该技术主要结合单细胞基因组测序与传统表观组高通量测序方法，如BS-seq和ChIP-seq等。

3.    单细胞测序的应用领域

1)    早期胚胎学

在胚胎发育过程中，许多组织结构和过程的作用机制尚不明确。相比传统方法，SCS技术具有优势。

它能够避免母体干扰，通过建立体外培养系统和独立创建模型，帮助研究靶向生物标志物以及多系统（如胚胎-神经系统）参与的生物机制。

2)    免疫学

通过利用免疫应答的特异性，结合多种方法和学科，SCS技术可以实现单一学科无法完成的功能。

例如，免疫细胞的单细胞测序可以用于预测肿瘤免疫治疗效果，研究自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病的治疗，探讨衰老与免疫反应的关系，以及研究包括新型冠状病毒在内的细菌、病毒及其他微生物与免疫反应的相互作用。

3)    肿瘤学

通过对骨髓异常引起的白血病进行单细胞测序，并对比患者与对照组的基因表达水平，可以较为轻松地识别与炎症相关的通路以及与骨髓系白血病相关的敏感基因。

在黑色素瘤的治疗中，单细胞测序技术可用于识别黑色素瘤的预后亚型，特别关注肿瘤微环境中的免疫细胞和成纤维细胞。

4)    微生物学

通过利用SCS技术检测大豆胞囊线虫抗性基因的表达差异，可以识别出某些特有的序列多态性，这些多态性与线虫抗性相关，从而帮助开发抗线虫毒性的方法。

同样，在曼氏血吸虫的研究中，利用SCS技术可以深入了解其生命周期不同阶段的特点和作用，有助于制定更有效的防治策略。

5)    神经生物学

对神经元和神经胶质细胞的研究有助于揭示特定突变与某些人类疾病的关联，以及突变与衰老过程的关系。

通过在单细胞和神经元池中应用转录组技术，结合激光捕获神经元和海马区的基因表达谱，可以对比患病与正常人群，从而确定神经疾病的基因靶点。

同样，SCS技术还可用于评估有毒有害物质对神经组织的损伤程度及其毒理机制。

6)    干细胞研究

传统干细胞研究的局限在于干细胞分化可能引发成瘤性，同时大多数肿瘤干细胞缺乏特异性标志物，且组织定位和形态特征不明确，导致无法直接从肿瘤细胞中分离，从而增加了研究的难度，有时甚至无法进行。

将SCS技术应用于干细胞研究，可以拓展研究领域，如器官再生、生物过程解析和生物效应研究等。