核酸扩增技术

1.    核酸扩增技术介绍

核酸扩增技术是针对核酸（包括DNA和RNA）的一种实验方法，旨在从少量的起始核酸样品中扩增出大量的目标核酸。

其中聚合酶链反应（PCR）是第一个并且仍然是最流行的用于扩增和检测低丰度核酸的扩增技术。

等温循环扩增无需PCR的热循环，可以在恒温下实现快速有效的扩增，使得等温循环扩增技术成为PCR的有利代替者。

等温核酸扩增技术通常包括酶辅助扩增法和无酶扩增法。

酶辅助的扩增策略包括滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）、指数扩增反应（EXPAR）等；无酶扩增法包括链置换扩增（SDA）、杂交链式反应（HCR）、DNAzyme、熵驱动回路（EDC）、催化发夹自组装（CHA）等。

同时，等温扩增技术检测目标广泛，包括蛋白质、细胞、小分子和离子等。

2.    等温酶辅助的信号放大技术

1)    滚环扩增（RCA）

滚动环扩增（RCA）是一种高度特异且灵敏的核酸扩增技术，利用环状DNA模板和DNA聚合酶进行连续扩增。

其基本原理是通过在环状DNA模板的特定起始点加入引物，DNA聚合酶启动扩增并沿模板滚动合成新的DNA链。

此过程不断重复，生成大量长链的重复单链DNA产物。

与传统的PCR不同，RCA扩增不需要热循环过程，因而可以在常温下进行，操作简便，且扩增产物量大，适用于低浓度目标核酸的检测。

RCA不仅具有高灵敏度，还可通过设计特异性探针进行靶向检测，因此在分子诊断、病原体检测、基因分析及生物传感器开发等领域有广泛应用。

RCA扩增产物的长链结构也可用于微流控设备、纳米技术及单分子检测。

2)    环介导等温扩增（LAMP）

环介导的等温扩增（LAMP）是一种高灵敏度的等温核酸扩增技术，采用特定的引物和聚合酶在恒定温度下进行DNA扩增。

LAMP通过四种或六种特异性引物与DNA模板结合，形成一个具有内外环结构的复杂二级结构，能够迅速且高效地扩增目标DNA序列。

该方法的核心优势是等温反应，不需要复杂的温度循环设备，可以在常温或较低温度下进行操作。

LAMP扩增反应的关键在于形成环状扩增产物，通过聚合酶的合成活性在不断的循环过程中产生大量的DNA产物，通常是特征性的“树枝状”结构。

LAMP技术具有非常高的扩增效率和灵敏度，能在短时间内检测到极低浓度的目标DNA，且扩增产物可通过肉眼观察，如使用溶液的浑浊度变化或通过染料荧光检测。

3)    指数扩增反应（EXPAR）

指数扩增反应（EXPAR）是一种等温核酸扩增技术，利用短的引物和特定的酶在恒定温度下进行快速扩增。

EXPAR的基本原理是通过引发一系列特异性的扩增反应，使得目标DNA或RNA序列在短时间内以指数级增长。

该方法的关键在于两条引物：一条引物与目标DNA模板结合并启动扩增反应，而另一条引物则与产生的扩增产物结合，并通过一系列的催化反应促进新链的合成。

随着反应的进行，产物会呈指数级扩增，最终生成大量的目标序列。

EXPAR的特点在于其快速和高效，通常只需要较短的时间（例如30分钟内）即可完成扩增。

由于不需要热循环设备，EXPAR也适用于资源有限的环境，适合现场应用。

3.    等温无酶驱动信号扩增技术

1)    熵驱动回路

熵驱动回路（EDC）是一种基于熵变化原理的自组织系统，用于模拟和实现复杂的生物分子反应或信息处理过程。

这种回路的设计灵感来源于热力学中的熵增原理，利用分子之间的熵变化来驱动系统的自我调节与信息传递。

在熵驱动回路中，系统中的分子（通常是DNA、RNA或蛋白质等生物分子）通过特定的相互作用和结构变化，在局部区域减少熵，同时导致系统整体熵的增加。

这种熵变化推动反应或信息流动，完成复杂的功能，如自我复制、信号转导、计算处理等。熵的变化不仅在物理和化学反应中起作用，还能在分子级别上进行信息编码和传递。

2)    杂交链式反应（HCR）

杂交链式反应（HCR）是一种通过核酸分子间的特异性杂交反应实现信号扩增的技术，主要用于高灵敏度地检测目标核酸序列。

其基本原理是利用两条特定设计的引物，这两条引物具有互补序列，可以在目标核酸存在的情况下进行相互作用，形成一个自催化的级联反应，从而实现信号的放大。

与PCR等传统扩增技术不同，HCR不依赖酶类的参与，因此避免了酶的温度敏感性，操作上较为简便。

其显著优势在于极高的灵敏度和特异性，因为反应是通过特异性引物的杂交和级联反应进行的，可以有效地放大微弱的信号。

此外，HCR反应的产物通常是长链结构，可以通过溶液浑浊度变化、荧光标记或其他方法进行检测。

3)    催化发夹自组装（CHA）

催化发夹组装（CHA）是一种基于核酸结构和催化反应的自组装扩增技术，广泛用于分子检测和分析。

其基本原理是利用特定设计的DNA发夹结构，在目标核酸存在的情况下触发自催化反应，导致扩增反应的进行。

CHA反应通常涉及两条发夹状DNA探针（称为发夹引物），这些引物在没有目标时保持稳定的发夹结构，互不结合。

当目标DNA或RNA序列存在时，它会与两条发夹引物结合，促使它们展开并相互结合，形成一个新的复合物。

这一过程激活了一连串的自催化反应，使得更多的发夹引物参与反应，逐步形成大量的双链产物，从而实现目标序列的放大。

CHA的特点是反应无需酶催化，依赖于核酸分子间的杂交和组装反应进行级联放大。

4)    DNAzyme

DNAzyme（DNA酶）是一类由DNA分子构成的催化剂，具有催化特定生化反应的能力，类似于蛋白质酶。

与传统酶不同，DNAzyme是由人工设计的DNA序列通过适当的折叠和结构形成特定的催化活性中心，使其能够执行类似于蛋白质酶的催化功能。

DNAzyme的功能通常依赖于其三维结构的折叠，这种折叠结构可以通过核酸序列的特定排列形成催化位点，从而促进底物的转化。

DNAzyme可以催化多种化学反应，包括核酸水解、磷酸化、脱磷酸化、金属离子催化等反应。

最著名的DNAzyme之一是“10–23 DNAzyme”，它能够催化RNA的水解反应，这一发现为基因靶向和RNA干扰等领域提供了重要工具。