单细胞封装方法

细胞的类型和状态千差万别（即细胞异质性），为了更好地探索细胞的未知特征和动态，深入了解组织、器官甚至整个生物体的行为，单细胞分析已成为一种流行且不可或缺的策略。

微流控液滴技术可用于生成高通量的微液滴，从而使对单细胞进行大规模并行研究成为可能。

虽然使用经典的微液滴方法，特别是基于被动液滴生成的方法，单细胞的封装率相对较低，但单细胞的总数量和吞吐量要比使用微孔和微图案等其他微流体单细胞操作方法高得多。

另外，微液滴可将单个细胞封装在纳升液滴中，从而进一步减少物质的稀释/交叉污染/吸附，提高氧气、营养物质和代谢物的交换效率，保持细胞活性和生物功能，促进单细胞水平的细胞研究。

同时微流控液滴技术可实现灵活的单细胞操作，并可将不同的细胞研究过程（包括细胞封装、培养、分离/分拣和检测）整合到一个设备中。

1.    液滴中的单细胞封装

液滴中的单细胞封装主要是通过流体动力学和表面张力操作实现的。

液滴大小由连续相的粘度、界面张力、微通道尺寸以及分散相和连续相的流速决定，液滴直径从几十微米到几百微米不等。

单细胞微液滴流量大、体积小，这些特点使其适用于高通量单细胞分析。

然而，单细胞的封装通常是随机的，尤其是在采用通常用于单细胞分析的被动液滴生成方法时。

1)    随机单细胞封装

在随机封装方法中，每个液滴的细胞数取决于细胞悬浮液的初始浓度和液滴体积，但会呈现高度随机分布，其中单细胞液滴的比例很低。

因此，必须进一步加强对单个液滴中细胞数量的控制。

为了提高单细胞封装的效率，一些研究人员采用了先随机封装再分类的方法。

上图介绍了一种用于生产和分拣单细胞微囊的微流体系统，通过该系统，能够在微流体设备中实现微滴和微凝胶的高通量制备。

重要的是，在将单细胞微胶囊转移到培养基中的同时，还使用了片上分选电极来完成单细胞微胶囊的筛选。

在细胞密度为每毫升 3.05 × 106 个细胞、液滴直径为 50 μm 的条件下，他们实现了 16% 的单细胞封装率。

分选后，单细胞封装率提高到 80% 以上。这种方法可用于整合液滴凝胶化、单细胞微凝胶分选和转移到培养基，从而在单细胞水平上进行高通量分析，全面评估细胞异质性。

2)    受控单细胞封装

如前所述，悬浮液中的细胞随机封装成液滴的过程结果一般遵循泊松分布，这通常会导致相对较低的单细胞封装率。

为了提高单细胞封装效率，可以在弯曲的微通道中使用惯性排序法将单个细胞封装到液滴中，在此过程中，惯性力和Dean力相结合，使细胞间距均匀。

通过使细胞流动周期与液滴产生周期相匹配，可以减少空液滴和多细胞液滴的数量，提高单细胞封装效率。

研究人员将螺旋通道和蛇形通道相结合，有效地聚焦了细胞和微珠。

他们用这种方法封装了条形码微珠和人类小鼠细胞，然后通过测序鉴定了细胞的异质性。

与传统的 Drop-seq 装置和仅用于聚焦微珠的装置相比，他们使用这种方法使细胞利用率分别提高了 300% 和 40%。

结果证明他们的微流控芯片提高了运行效率。这种芯片设计在实现高效单细胞表达谱方面具有巨大潜力。

2.    水凝胶中的单细胞封装

除了模拟三维（3D）微环境以支持细胞的活动和功能外，将单细胞封装在微尺度水凝胶中还可作为进行独立细胞操作和监测的良好工具，这对于探索单细胞在类似活体的微环境中的活动至关重要。

与单细胞包裹的液滴不同，微凝胶可形成三维网络结构，其形态可通过调整凝胶单体或聚合物的浓度来控制。

这确保了氧气、营养物质和生长因子的供应以及细胞代谢废物的及时排出，从而使在凝胶微球中长时间培养细胞成为可能。

通过应用适当的化学或物理方法，液滴中未固化的凝胶可被激活，转化为凝胶微球。

可用于生产封装单细胞的水凝胶微球有合成聚合物和天然聚合物两种材料。

1)    使用合成聚合物进行封装

在微流控液滴技术中，合成聚合物被用作生产细胞包封凝胶微球的材料，这种微球可通过化学修饰直接控制细胞微环境。

常用的合成聚合物包括聚（N-异丙基丙烯酰胺）和聚乙二醇二丙烯酸酯。

合成聚合物在分子量、结构和交联密度方面具有可调特性，可用于生产具有不同机械特性的凝胶微球，一般比天然水凝胶更强。

合成水凝胶胶囊含有一层几微米的半透壳，可用于基因组扩增等多步骤分子生物学检测。

一般来说，用紫外线聚合合成聚合物形成凝胶微球，用于包裹细胞。

细胞悬浮液含有光引发剂、交联剂和单体，用作分散相。

在微流控芯片中产生微滴后，光引发剂在紫外线的照射下，在交联剂的作用下促进单体的交联反应，生成凝胶微球。

研究者以聚乙二醇二丙烯酸酯为原料，在微流体流动聚焦装置中以 1 kHz 的封装速度形成包裹着多能人类间充质干细胞或牛软骨细胞的微液滴。

液滴通过下游通道的外部紫外线光源进行光交联，以制备细胞负载微凝胶并保持高细胞活性。

然后将流式细胞仪分拣出的单细胞微凝胶（纯度大于 90%）与不同的生物相容性材料（如聚乙二醇二丙烯酸酯和海藻酸）混合，制成各种模块化生物墨水，可用于 3D 打印，以单细胞分辨率重建细胞微环境。

2)    使用天然聚合物进行封装

与合成聚合物不同，天然聚合物是从生物体自身产生的代谢物中提取的。

近年来，天然聚合物因其良好的生物相容性和温和的聚合条件被广泛应用于细胞封装。

用于单细胞封装的天然聚合物包括海藻酸钠、琼脂糖、明胶、胶原蛋白和透明质酸，其中海藻酸钠、琼脂糖和明胶最为常用。

有研究人员提出了等源集落测序法，作为高通量分析细胞基因表达的通用方法。

在他们的方法中，单个酵母细胞被低熔点琼脂糖包裹，形成琼脂糖液滴，收集到 50 mL 离心管中，放在冰上形成琼脂糖微凝胶。

将琼脂糖微凝胶重新悬浮在合适的培养基中过夜培养，形成单个酵母细胞菌落微凝胶，为菌落深度测序提供足够的 RNA，并减少单个细胞基因表达谱中出现的误差。